1.构建动物模型并提取梗死组织中的蛋白质
通过向大脑中动脉人工注射栓子来构建MCAO模型，并在模型构建后的0，6，12，24h取梗死脑组织切片进行质谱分析。图A为各组大鼠的神经障碍评分：分数越高，代表神经功能受损越重。图B为TTC染色脑梗死组织切片2.差异蛋白分析
首先将0h组分别与6h,12h,24h组进行差异分析，并将3组差异蛋白取交集，共得到41个差异蛋白（图A），并绘制41种蛋白在23个样本的表达量热图（图B）。通过Cytoscape软件中的ClueGo插件对差异基因进行生物功能与网络分析，共得到4个模块（急性炎症反应，补体和凝血级联反应，细胞氧化解*和蛋白质活化级联反应）（图C）。通过GO和KEGG数据库对41个基因进行富集分析，显示6h、12h和24h基因的显著性（免疫反应功能：先天免疫反应、对细胞因子的反应、急性期反应以及补体和凝血级联反应，均显著增强），表明免疫在卒中发展中起到重要性作用（图D）。3.GEO数据集验证差异基因
选择两个GEO数据集进行差异分析，结果与上述实验结果类似。（如：Atp1a4在两个数据集的表达均显著下调。Apoa4、Hpx、Plg、Pzp、Serpina3和serinc1在GSE中的表达以及Ahsg、Alb、Apoa1和Orm1在GSE中的表达均在MCAO样品中上调，我们的蛋白质组学分析显示了相同的结果）。接着作者通过qPCR来验证差异基因，发现C3,AP0A4,SA9具有显著差异。
4.短时间序列分析（STEM）
STEM是一个Java程序，可用于聚类、比较和可视化来自短时间序列的基因表达数据，识别重要的时间表达谱以及与这些谱相关的基因。同时，STEM还可以对具有相同时间表达模式的基因集执行功能富集分析，例如GO富集分析。STEM分析结果显示了基因表达的时间动力学聚类的概况。每个折线图代表一个聚类群，相似时间动力学模式的基因被划分到同一聚类群中，折线图趋势代表了该聚类群中基因随时间表达的整体走向。彩色表示具有统计意义（显著时间特征）的聚类群，白色则表示无意义的聚类群。作者对4个时间点的蛋白表达数据进行分析，探索脑卒中进展过程中的基因调控网络。共得到两个cluster:cluster13(99个蛋白)与cluster0(42个蛋白)接着作者对两个cluster的基因进行生物学分析。图C为两个cluster中的蛋白在23个样本中的表达量热图，cluster13在4个时间组基因表达差异较为显著。图D为cluster13的GO-BP与KEGG富集分析结果，正如预期的那样，免疫相关功能，如补体和凝血级联，肽酶活性的负调控和先天免疫应答显著富集。图E确定cluster13基因簇的生物学功能，构建基因-生物学过程网络。图F在23个样本中显示了cluster13的基因表达模式。5.WGCNA分析
为了进一步确定脑卒中发展过程中基因的共同表达模式，作者对蛋白质组谱数据进行WGCNA分析。首先对样本进行聚类分析，去除离群样本（图A）。接着选取软阈值，当软阈值为9时，更符合无尺度网络（图B）。图C-D构建基因共表达模块并计算各个模块与卒中的相关性，turquoise模块相关性最高。对turquoise模块中的基因进行PPI网络分析，鉴定模块中的hubgene。将PPI网络中的节点与聚类13中的基因进行匹配。发现Apla1、Kng1、Pzp、Plg、Olf等基因既包含在cluster13中，也包含在turquoise模块中，它们与其他基因联系紧密，在网络中起着中心枢纽的作用。6.GSEA富集分析
接着作者进行了GSEA富集分析。图A-B展示了富集分数(ES)较高的前5个terms，包括凝血、补体、氧自由基通路、干扰素γ反应和凋亡，均在卒中过程中表达上调。图C-E分别为GO富集分析、GSEA的miRNAs和转录因子在6h与0h、12h与6h、24h与12h比较时的富集分数以heatmap表示。7.总结
本研究结果揭示了炎症反应、细胞因子-细胞因子受体相互作用、先天免疫反应和活性氧（ROS）是卒中后非常活跃的通路。C3、Apoa4与Sa9可能是脑卒中的生物标志物或药物靶点。四、讨论本文是一篇非肿瘤的实验+生信类文章，工作量还算可以（毕竟动物实验较为耗费精力），这也是心脑血管领域的共有的一个问题，取材较为困难，大多需要构建动物模型。作者的生信分析工作并不困难，但笔者认为作者的外部数据集验证并不是很契合，这也是非肿瘤生信分析的一个通病，相较于肿瘤数据较为杂乱。但相较于肿瘤来说非肿瘤生信文章相对好发，本文投稿时影响因子为6.9，最新预测因子已接近10分。这样来看，收获还是很客观的，在座的各位是不是已经心动了，有需要生信服务的小伙伴可以扫面下方